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外泌體（Exsome）發(fā)展歷程：

外泌體的發(fā)現(xiàn)要追溯到1986年，Eberhard G. Trams和R.M.Johnstone在體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞培養(yǎng)液上清中發(fā)現(xiàn)了一種有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，并將其命名為Exosome（外泌體）。隨后的10年，外泌體并未受到足夠的重視。直至1996年，G.Raposo發(fā)現(xiàn)類似于B淋巴細胞能分泌抗原提呈外泌體，這種外泌體攜帶MHC-Ⅱ類分子、共刺激因子和粘附因子。研究表明這種B細胞來源的外泌體可以直接刺激效應CD4+細胞的抗腫瘤反應。1998年，L.Zitvogel等發(fā)現(xiàn)樹突細胞（DC cell）也能產(chǎn)生有抗原提呈能力的外泌體，而且外泌體含有功能性的MHC-Ⅰ類和Ⅱ類分子，還有共刺激因子。這種外泌體啟動了特異性的CTL殺傷作用，促進了T細胞依賴的抗腫瘤效應。

2007年，H.Valadi等發(fā)現(xiàn)，細胞之間可以通過外泌體中的RNA來交換遺傳物質(zhì)。這意味著細胞可以通過外泌體影響另外一個細胞，甚至可以把自己的基因強加給另外一個細胞。研究人員逐漸對小小的外泌體產(chǎn)生了極大的好奇。他們發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的外泌體與正常細胞的外泌體之間存在差異，腫瘤的外泌體會促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，腫瘤周圍組織細胞分泌的外泌體具備殺傷腫瘤細胞的能力，等等。2013年的諾貝爾生理或醫(yī)學獎頒給了三位科學家，他們分別是美國科學家James E. Rothman和Randy W. Schekman，德國科學家Thomas C. Südhof，以表彰他們發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)部囊泡（外泌體等）運輸調(diào)控機制。使外泌體的研究達到全新的高度。就外泌體的研究方向而言，干細胞、免疫、microRNA、靶向給藥、癌癥的診斷及治療等都是熱門研究領域。

2015年JHuan等人證實了急性髓細胞白血病（AML）的外泌體在白血病的骨髓微環(huán)境中具有抑制造血干細胞的功能。同年WANGY等人發(fā)現(xiàn)誘導多能干(iPS)細胞的外泌體可以在心肌細胞受到急性心肌缺血（MIR）影響時，給心肌細胞傳送保護信號。

目前，已有越來越多的學者開始關注外泌體在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機制，外泌體將在癌癥的診斷及治療等領域發(fā)揮重要作用。2015年德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的一項研究在6月24日的《自然》（Nature）雜志上發(fā)布，研究發(fā)現(xiàn)存在于癌癥外泌體（exosomes）上的glypican-1 (GPC1)基因編碼蛋白，或許可以作為一種潛在非侵入性診斷和篩查工具的組成部分，用來檢測有可能尚處于適合手術(shù)治療階段的早期胰腺癌。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌小鼠模型還未顯示出MRI可以檢測到的胰腺疾病跡象之時，GPC1+ crExos就檢測到了胰腺癌的可能性。相比常用的CA 19-9生物標志物，GPC1+ crExos似乎是一種更可靠的篩查工具。

“不同于循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)需要大量的新鮮血液，在大約30年前保存到冷凍庫的血液樣本中也可以檢測和分離出GPC1+ crExos。可以從儲存樣本分離出的癌癥外泌體中提取出DNA、RNA和蛋白質(zhì)，用于進一步的遺傳和生物分析。因此，癌癥外泌體不僅僅是一種生物標記物，分離出它們還可為我們提供一個癌癥特異性信息的寶庫。”由于胰腺癌確診時常常已到晚期，只有15%的患者適合于接受手術(shù)。如果能夠早期檢測到癌癥，就可以采用胰十二指腸切除術(shù)來治療胰腺癌患者。

目前有關外泌體的研究，主要集中在外泌體顆粒的提取、純化和內(nèi)容物分析上。其中，外泌體的粒徑表征和濃度信息是極為重要的參數(shù)。

外泌體的分離

目前，外泌體的分離多采用超速離心、磁珠免疫捕獲、沉淀或過濾三種方法。

超速離心：耗時耗力，往往需要8-30個小時；每次zui多只能處理6個樣品；需要大量的起始材料；產(chǎn)量不高。需一臺超速離心機。

磁珠免疫捕獲：利用外泌體表面*的表面標記物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合，即可將外泌體吸附并分離出來。磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點，但是效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實驗，難以廣泛普及。

外泌體分離：

通過簡單離心，從體液、血液、尿液、細胞中分離外泌體（Exosome），相比超速離心，安全、快速，經(jīng)過兩次柱子純化，很好的去除了白蛋白，從而獲得高純度和高產(chǎn)量的外泌體。

外泌體RNA/蛋白的分析

目前，通常使用組織診斷法進行癌癥檢測，如熒光原位雜交（FISH）和免疫組織化學（IHC）。但是這樣基于組織診斷的方法具有很大的局限性，因為需要較大量的組織樣本，其不能對癌癥變化進行實時監(jiān)控，不能準確地反映當前的疾病狀態(tài)。而外泌體診斷測試通過從尿液、血液和體液中提取的外泌體獲得遺傳信。Exosomes是由所有含RNA、DNA和蛋白的活細胞釋放的信使。因為Exosome包含來源于母細胞的信息，因此在腫瘤學上，基于外泌體的體液活檢對整個腫瘤活動提供了一個實時監(jiān)控并可對疾病的重要變化進行檢測。

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