細胞培養中的黑膠蟲污染

摘要：預防和避免污染是細胞培養成功的關鍵，黑膠蟲（也稱黑焦蟲）是近幾年來幾乎出現在每個細胞培養實驗室。但是現在無法對黑膠蟲的確認和鑒別，導致學術界說法不一，筆者收集了關于黑膠蟲的資料，對黑膠蟲進行類系統描述，對黑膠蟲出現的情況對細胞培養的影響以及黑膠蟲污染后的有效處理進行介紹。
關鍵詞：黑膠蟲 污染處理 細胞培養
The pollution of black dots in cell culture

(Grade 2005, Biotechnology, School of Life Science and Engineering)

Abstract  Pollution prevention is the key to success in cell culture, black dots (also called black particles) almost appeared in every cell culture laboratory in past few years .But now no one able to confirm and identify what the black dots is. This lead to appear different academic arguments.The author collected information about the black dots to make a description about black spots which similar to the systemic description,and Introduce when aand where the black dots come out. At the same time give some advice to deal with the black dots.

Key words  Pollution  black dots   cell culture

                       前言
污染是細胞培養的大敵。預防和避免污染是細胞培養成功的關鍵之一。一開始就要十分重視，防止污染，否則會前功盡棄，不僅浪費時間，而且浪費人力、物力，甚至造成無法彌補的損失。
細胞培養中常見的生物污染類型有7種，分別是細菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細胞污染。他們在細胞培養中污染的特點如下：
1、細菌：細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，根據感染細菌的不同，可有不同的外形，培養液一般會渾濁變黃，對細胞生長影響明顯。
    2、支原體：黑色的，好象多為多形，培養液一般培養液一般會渾濁，原體感染，國內血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中zui常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細胞以后，細胞病變不很明顯，只是慢慢死去。
    3、黑膠蟲：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養液也是不渾的，一般不會太影響，細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養的細胞中發現類似現象。對細胞生長狀態不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。
    4、真菌：一般培養液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細胞碎片分不清，慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細菌那么容易被發現，但是一旦發現有它的存在細胞就被污染了，也很難救活了。
     5、原蟲：培養液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多，輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態不好，邊緣不清楚，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養。這種共生是非常普遍的，但他們的數量小，細胞站優勢所以不會影響到細胞的正常生長，只有當他們到達一定的數量時就會影響到細胞的生長，zui終形成惡性循環。
6. 病毒：組織細胞培養過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養中已發現不少于20種血清性病毒。 盡管病毒污染的細胞不影響原代培養，但生產疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題
    7、非同種細胞污染 ：即是細胞交叉污染，由于細胞培養操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。非細胞培養物所造成的化學成分的污染也偶有發生，大多是由于細胞培養所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學物質所致。
在上述的八種污染物中，黑膠蟲是現代細胞培養中討論比較多的，但大多數文獻未對其進行描述或一帶而過，就像上面關于描述黑膠蟲的情況是不完整，還有很多不明的情況。對其身份有多種猜測，到現在都沒有地對黑膠蟲進行分類學上的歸類。黑膠蟲到底是不是一種生物，如果是那黑膠蟲會是何種生物，如果不是，那黑膠蟲會是什么？一系列的問題都懸在奮斗在細胞生物學領域的學者們的心中。
1關于黑膠蟲的描述
1.1分類上的描述
對于黑膠蟲的分類，學術界沒有明確給予說法。關于黑膠蟲的分類，目前大部分人認為黑膠蟲污染是微生物感染。在一些文章論述上把黑膠蟲歸為生物污染類型，但是沒把它歸為確定的生物分類類型，只是把黑膠蟲獨立為一種未知生物。而根據中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內的一種原蟲，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，但是由于課題經費不夠而不能繼續下去，zui終也沒有有力證明黑膠蟲是屬于原蟲。也有一些學者不認為所謂的黑膠蟲污染是一種生物污染，而認為是細胞碎片類物質，是在細胞培養時，細胞衰亡破裂產生的；也有在文獻中報道說是玻璃瓶中類似氧化硅的物質，那個文獻很少人找得到；還有報道黒膠蟲是一種納米級的細菌。

1.2形態上的描述
形態上類似與桿狀細菌，但長度比細菌長，直徑約在0.5~1微米，不染色觀察為黑色；膠蟲成熟后呈線狀，而且形態是橢圓形。

1.3運動形式
在400X倒置顯微鏡小，有典型的布朗運動（不規則的原地小距離抖動），即很多細胞培養者看到的，像黑色的小蟲游來游去。可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。但是在物理學上來說，顆粒足夠小，在液體中也是做布朗運動的，這不足以說明黑膠蟲的布朗運動就證明它是生物。

1.4生理上的描述
1.4.1抗性
抗細菌和抗霉菌的藥物對黑膠蟲均無效，可以保守的判定黑膠蟲不屬于細菌。
1.4.2環境抗逆性
將培養器材150度烘烤8小時，可以消除，這個黑膠蟲高壓滅菌泡酸都不死。可見黑膠蟲可以耐高溫高壓，而且還有點嗜酸，如果證實它是生物的話，那它很有可能是微生物，一種古菌。
1.4.3營養條件
“黑膠蟲”可寄生于動物細胞，也可以生存于培養基中，依靠細胞和培養基中的營養為生，并隨細胞傳代而傳代。可見“黑膠蟲”是一種異養生物。
2對黑膠蟲的各種猜測及相應的處理
2.1非生物類
2.1.1細胞碎片類
在細胞培養的時候， 由于細胞代謝、物質交換、周邊環境變化，尤其是在從37度培養箱中拿出來觀察的過程中，由于液體培養基的比熱較大，液內溫度高于外界溫度，造成冷熱交換、小范圍內形成液體流動加劇，當然這些小歲末就會被攪動起來形成似乎“游動”的感覺；隨著細胞培養的繼續，部分細胞開始衰亡，細胞膜結構破裂，破裂之后的細胞內容物泄露到培養液中。尤其是溶酶體的破壞，連續性地造成其他細胞和細胞器的損傷，如果換液不很勤，又會出現進一步破壞和殘渣的出現；再者，“黑焦蟲”問題是很多細胞培養者已經發現的問題，但到目前為止尚未找到其監測和排除的試劑和手段，這首先是由于所謂“黑焦蟲”病原體根本難以收集和捕捉， 這也從另一個側面證明了“黑焦蟲”問題的難以確定性；再說任何一種外來的微生物在培養基中都會有生命活動的反應和表現，而不是簡單地運動那樣的外觀性表現。舉一個例子：如果“黑焦蟲”的運動狀況已經到了用顯微鏡已經可以觀察出的程度，其營養代謝和能量需求也就可想而知。這樣，培養液中的影響消耗、酸堿含量程度等都要發生明顯變化。比如說：迅速的、大含量的沉淀， pH值的迅速下降，細胞大量破碎死亡、引發其它類型微生物侵染等等。而這些狀況，在所謂的“黑焦蟲”感染中，是很難觀察到的。同時“黑焦蟲”的出現而影響細胞狀態似乎得不到有力的證據。倒是細胞狀態下降的時候，“黑焦蟲”明顯增多了。很有可能是細胞狀態下降時，細胞衰亡產生的細胞碎片。所以黑膠蟲屬于細胞碎片是比較可能和合理的。
2.1.2玻璃培養瓶中的類似氧化硅的東西
網上有一篇文章說，黑膠蟲其實不是一種生物，是無機物，其本質是玻璃培養瓶里的硅顆粒。可影響細胞生長，細胞狀態好時，不明顯。細胞狀態較差，數量少時才容易看到，的辦法是用一次性培養瓶，可消除黑膠蟲影響。
2.1.3血清聚合物產物
gibco公司的血清說明，此物為血清聚合產物，而不是微生物
2.2生物類
2.2.1支原體
有人曾認為黑膠可能是支原體污染，因為相對比較的文章指出，黑膠蟲可以通過濾膜，可以在空氣中傳播。而恰巧口腔支原體為人體口腔中之正常菌叢，所以實驗室之操作人員的污染亦可能為支原體的污染源。但有人為此做了實驗證明黑膠蟲不會是支原體，原因如下：
1、光鏡下可見, 因為體積不對，支原體在普通顯微鏡下不能看到。
2、多種染色后可見，甚至hoechst即能將它染色,一般來說支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。所以，黑膠蟲是一種支原體的可能性比較小。
2.2.2真菌
有很多人發現類似黑膠蟲的，但zui后確定是真菌，二性霉素B對其有效。那說明黑膠蟲不存在只是細胞培養中的真菌感染，還是說明黑膠蟲污染屬于真菌類污染物。如果黑膠蟲是一種真菌，那么由此引起的污染是不會引起那么多人的關注，即使它很特殊。但是這不能排除那些認為“黑膠蟲”是真菌的細胞者，看到的只是一般真菌感染。由于細胞被感染了，要進行拯救處理，不像理論上那么簡單，稍有不注意都是很容易導致培養失敗，所以黑膠蟲是一種真菌也是不太可能。
2.2.3寄生類原蟲
黑膠蟲屬于寄生類的原蟲，而不是細菌、支原體，也不是什么補體、細胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍鏡下可以清楚的看到膠蟲有兩種不同形態，一種較大，運動較慢，泛紅光；另一種較小，運動較快，紅中帶綠，個小的圍著個大的分布，很可能是公的圍著雌的。這種生物也并非離開細胞就不能存活，也有人做過這樣的試驗，單純培養過污染膠蟲的血清4周，直到滿視野都是黑煤渣般的膠蟲。給人的感覺是膠蟲和細胞一樣有叢集性，如果膠蟲密度低則生長緩慢，如果手懶，拖了幾天沒換液，待膠蟲生長到一定濃度后便會飛速分生，細胞受感染的程度也大，這時除了培養基中可見外，細胞表面通常也象長滿了粉刺，所以有人認為細胞旁分泌的某些因子可以抑制膠蟲的生長。據說，中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內的一種原蟲，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，然而由于課題經費不夠而不能繼續進行下去。由此黑膠蟲屬于原蟲的有比較大的可能性。

3關于黑膠蟲出現的幾種情況
1.“黑膠蟲”的出現常在培養條件改變、細胞接種密度降低、細胞狀態不佳時顯現并使實驗中斷，尤其在凍存細胞復蘇時可造成大量細胞死亡。就是在細胞生長狀態不良時，黑膠蟲容易出現。“黑膠蟲”生長與細胞的生長有此消彼長的關系，即當細胞狀態好時小黑點會相應的減少；反之則增加，似乎有細胞競爭生長的關系，但總的來說它的出現似乎并不影響細胞的生長。
2.細胞剛用的時候，觀察均生長良好，密度適中，培養液清亮，小黑點一般不出現，但是對細胞傳代以后就陸續出現多少不等的小黑點，有時候在一夜之間暴長。細胞進過多次傳代的情況下，也會使黑膠蟲出現。
3.換用了其他公司的血清，多是北方公司的血清，就出現了這種非常類似這里的”黑膠蟲“的情況。在北京醫科大學/中國協和醫科大學聯合出版社出版的《現代實驗血液學研究方法與技術 》書中關于檢查血清中寫道，“我國北方小牛血清還多見黑膠蟲污染”。其實在很多，遭遇黑膠蟲的案例中，大部分細胞培養者都認為黑膠蟲來源于血清。

4關于再細胞培養中出現黑膠蟲后的幾種處理建議
1．換好一點的血清，當然是進口胎牛血清（國產血清太臟），就是價格高的離譜，經濟條件不允許，可以用進口新生牛血清代替。建議如果使用的是Hyclone或GIBCO的血清可不必滅活，這樣可以有效減少“小黑點”的形成。一般的血清都不要去滅活處理，為什么呢？INVITROGEN公司在其血清說明書上解析道：經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經過熱滅活的血清，沉淀物的形成會顯著增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。除非是在做免疫學研究或培養干細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，才推薦做熱滅活。所以在不是做免疫學研究或培養干細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞培養時，血清盡量不經熱滅活。

2．如果是貼壁細胞的話，可用無菌的PBS洗幾次，可一定程度上緩解。若是懸浮的話，就不太好處理拉，可以向其中少加一點滋養細胞。加滋養細胞對有黑膠蟲的剛復蘇的細胞很有效！還有就是實驗環境要注意好，保持細胞間整個環境的潔凈度。如果細胞不是非常珍貴，可以用伯氨奎、磺胺、四環素、貝尼爾，也有建議慶大霉素500ug/ml洗滌。
3．換用進口的一次性塑料培養瓶。
4．停止復蘇，停止養細胞，*消毒所有用于細胞培養的一切用品，包括所用的培養瓶，培養基，吸管，胰酶，孵箱，超凈臺、空間等等你能想到的和細胞培養相關的所有物品。一個星期后，再復蘇污染之前凍存的細胞，注意你的白大衣衣袖污染即可。這樣你可能覺得動作太大，但可以用一個星期的時間挽救兩個月的時間，還有其他你為了找到污染源，去除污染所耗費的精力，和財力。
5．在換液前先加入生理鹽水并輕輕拍打，沖洗干凈后再加入培養液，堅持天天洗，傳代時加生理鹽水再離心一次，接種密度稍大一些，一段時間后，蟲子就會大大減少，對細胞的生長也不會有大的影響。
所有東西重配；如果實在要搶救，重點突破，留幾瓶污染不是很嚴重的細胞搶救，其余棄去
6．如果有其它可用的細胞，那么污染的細胞扔掉；如沒有，可試著用抗生素，zui可靠的是細菌培養加藥敏，據藥敏結果選擇抗生素，當然不能影響到細胞的狀態。
7．有材料稱minocycline具有一定的作用，可以和換液結合起來使用。
由于黑膠蟲尚未明確鑒定出是什么生物，所以上述的處理方法不一定正確，可以供考慮采用。
8.有人為尋找到殺滅“黑膠蟲”的方法，做了一個試驗，他取有“黑膠蟲”污染的六孔板，每孔內有2ml培養液，向有污染的孔內分別加入0.5ml、1ml、2ml、3ml的新潔爾滅原液，邊加邊在倒置顯微鏡下觀察。zui后他得出結論：新潔爾滅與水或培養基的比例為1：4時即可殺死“黑膠蟲”。但是新潔爾滅對細胞的負面影響太大，比較珍貴的細胞培養不采用此方法。
5.國外關于黑膠蟲的相關情況
在國外的生物論壇上也有很多人在討論black dots 和black particles，也就是我們所說的黑膠蟲。他們所描述black dots 和black particles的情況，基本上和國內論壇上相似。國外有人用實驗證明black dots 或black particles 不是支原體，而在細菌范圍內。基本過程如下：If the poster is concerned about mycoplasma, there are tests to identify them. One is a Hoechst dye staining technique to look for extranuclear DNA spots.Also, prepare a dry flame-fixed smear from another aliquot of the media (5-10 ul) and stain with crystal violet. See under microscope at high magnification if there is anything resembling bacteria. And by the way, estimate the size of the particles to be sure it is in the range of bacteria.


6總結
從前面關于黒膠蟲的描述可以看出，人們遇到的黒膠蟲并不都是一樣的，有象細菌的、有象支原體的、有象原蟲的、有象真菌的，還有象細胞碎片的。在國內個實驗室的器材條件參差不齊，而且實驗人員的操作質量也不盡相同，同一種現象也可能有些許差異，當用描述出來的現象的差異可能變大也可能變小。所以很多人看到細胞被細菌污染了，不好處理，而卻描述出來的現象和流傳的黑膠蟲類似，就會把培養失敗的原因歸結到的黒膠蟲污染，甚至可能說它發現的是真正的黑膠蟲。這樣的事情多了，黑膠蟲就會人為的變種，象什么的都有。黑膠蟲是否存在，還有待于科學的發展。但有一點可以肯定的，大部分人發現的“黒膠蟲”并不是真正那個未知的黒膠蟲，而是不很常見的細菌、真菌、原蟲等微生物污染。